無色桿菌屬通用PCR檢測試劑盒說明書

注意事項：1．基礎(chǔ)程序；2．?dāng)U增溫度和延伸溫度；3．反應(yīng)時間；4．循環(huán)次數(shù)；5．PCR 反應(yīng)液的配制；6．PCR技術(shù)的基本原理；7．PCR的反應(yīng)動力學(xué)；8．PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；9．PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件。

原理是由一對引物介導(dǎo)，能在動植物體外對特定基因(DNA)片斷進(jìn)行快速酶促擴(kuò)增，經(jīng)過n個熱循環(huán)擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物中所含特定基因數(shù)是原始模板數(shù)的(1+E)n(0＜E＜1,擴(kuò)增效率＝倍，使得檢測擴(kuò)增產(chǎn)物中的特定基因成為可能。
 特異性強(qiáng)
PCR反應(yīng)的特異性決定因素為：
①引物與模板DNA特異正確的結(jié)合；
②堿基配對原則；
③Taq DNA聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性；
?
實(shí)驗(yàn)過程：
一、試劑準(zhǔn)備
1. DNA模板
2．對應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計的引物。可以是DNA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。
4．PCR的電泳檢測：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。

5%葡萄糖肉湯培養(yǎng)基/5% Dextrose Broth Medium藥品細(xì)菌培養(yǎng)，滴眼劑金黃色葡萄球菌培養(yǎng)等250克國產(chǎn)/進(jìn)口

大鼠腸靜脈內(nèi)皮細(xì)胞*培養(yǎng)基100mL

A9(小鼠下結(jié)締組織細(xì)胞)5×106cells/瓶×2

亮白曲霉 Aspergillus candidus小鼠成骨細(xì)胞*培養(yǎng)基

PANC-1, 人胰腺細(xì)胞豇豆慢生瘤菌 Bradyrhizobium vigna

糖膽發(fā)酵管培養(yǎng)基/Lactose Bile Broth用于大腸菌群、糞大腸菌群、大腸桿菌的測定250克國產(chǎn)/進(jìn)口

沙氏BHI瓊脂/沙氏腦心浸瓊脂/Sabouraud BHI Agar真菌檢測250克國產(chǎn)/進(jìn)口

Lane Marker Loading Buffer(5x)/蛋白示蹤上樣緩沖(還原,5x)5ml5ml

CCL-149(大鼠肺泡上皮細(xì)胞)小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（EGFP標(biāo)記）

SOC肉湯/SOC BrothBR250克國產(chǎn)/進(jìn)口

釀酒酵母 Saccharomyces cerevisiaeU-937(人組織細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞)

無色桿菌屬通用PCR檢測試劑盒說明書酸球菌亞種 Lactococcus lactis subsp. lactis核側(cè)耳 Pleurotus tuber-regium

冬擬多孔菌吳茱萸堿

枯草芽胞桿菌 Bacillus subtilishDPSCs, 人前磨牙牙髓干細(xì)胞

HBL-100(人整合SV40基因的腺上皮細(xì)胞)煙曲霉 Aspergillus fumigatus

酸球菌霍氏亞種 Lactococcus lactis subsp. hordniae大豆慢生根瘤菌 Bradyrhizobium japonicum

苜蓿中華根瘤菌 Sinorhizobium melilotiLLC(小鼠肺細(xì)胞)

Saos-2，人成骨瘤細(xì)胞泡盛曲霉 Aspergillus awamori

戊糖桿菌 Lactobacillus pentosus嗜熱脂肪芽胞桿菌 Bacillus thermophilus

毛柄金錢菌(金針菇) Flammulina velutipesHCG803/胃細(xì)胞

蘇云金芽胞桿菌蘇云金變種 Bacillus thuringeinsis subsp. thuringeinsis釀酒酵母 Saccharomyces cerevisiae

中性蛋白酶(含100mL酶解緩沖液)黑曲霉 Aspergillus niger

泡盛曲霉 Aspergillus awamori大鼠卵巢上皮細(xì)胞*培養(yǎng)基

百脈根根瘤菌 Rhizobium loti酸球菌脂亞種 Lactococcus lactis subsp. cremoris

Molt-4/急性淋巴母細(xì)胞白血病細(xì)胞阿舒假囊酵母 Crebrothecium ashbyii

炭黑曲霉 Aspergillus carbonarius小鼠肝星形細(xì)胞*培養(yǎng)基

雪白小四孢菌 Microtetraspora niveoalba寡養(yǎng)單胞菌 Stenotrophomonas sp.

技術(shù)原理：
 DNA的半保留復(fù)制是生物進(jìn)化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解鏈成單鏈，在DNA聚合酶與啟動子的參與下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則復(fù)制成同樣的兩分子挎貝。
       在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，DNA在高溫時也可以發(fā)生變性解鏈，當(dāng)溫度降低后又可以復(fù)性成為雙鏈。因此，通過溫度變化控制DNA的變性和復(fù)性，并設(shè)計引物做啟動子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復(fù)制。（ DNA高溫變性低溫復(fù)性）
       發(fā)現(xiàn)耐熱DNA聚合同酶--Taq酶對于PCR的應(yīng)用有里程碑的意義，該酶可以耐受90℃以上的高溫而不失活，不需要每個循環(huán)加酶，使PCR技術(shù)變得非常簡捷、同時也大大降低了成本，PCR技術(shù)得以大量應(yīng)用，并逐步應(yīng)用于臨床。